Модульная конструкция

Проточный цитометр Attune^® NxT с акустической фокусировкой является модульной системой с возможностью выбора до 4 лазеров и до 14 цветов для удовлетворения широкого спектра исследовательских и бюджетных запросов. Цитометр Attune^® NxT совместим с большинством известных флуорофоров и флуоресцентных белков, что позволяет проводить на нем эксперименты с привычными вам реактивами. При подключении лазера 561 нм прибор приобретает спсобность детектировать большое количество флуоресцентных белков. Хотите ли вы собрать прибор своей мечты сразу или постепенно достраивая до оптимальной конфигурации, цитометр Attune^® NxT всегда готов развиваться вместе с вами в соответствии с вашими лабораторными потребностями.



Рис. 1. Иммунофенотипирование. Многопараметрический (10-цветный) анализ регуляторных T-клеток мыши и дендритных клеток на цитометре Attune^® NxT. Лимфоциты были отобраны по параметрам FSC/SSC (А, слева), затем B-клетки, экспрессирующие B220, исключены из дальнейшего анализа (А, в середине). Среди клеток B220–, CD45.2+ T-клетки были выбраны по экспрессии CD3 (А, справа). Т-клетки CD3+ разделили на две популяции по экспрессии корецепторов CD4 и CD8 (B, слева). Среди T-клеток CD4+ была выявлена субпопуляция супрессивных регуляторных T-клеток, которые экспрессируют фактор транскрипции Foxp3 и поверхностный клеточный маркер CD25 (IL-2Rα) (B, справа). Клетки CD3– были отобраны для выявления редкой популяции CD11c+ MHCII+, специализированных антигенпрезентирующих дендритных клеток (С, слева). Дендритные клетки селезенки далее можно разделить на субпопуляции дендритных клеток CD11b+ и CD8+ (С, справа), каждая из которых обладает уникальными антигенпрезентирующими свойствам.
 

Рис. 2. Детекция флуоресцентных белков в живых клетках. Клетки U2OS одновременно подвергли трансдукции реактивами Cellight® Nucleus-GFP (артикул C10602) и CellLight® Plasma Membrane-RFP (артикул C10608). на цитометре Attune® NxT, используя лазер 488 нм с фильтром эмиссии 530/30 и лазер 561 нм с фильтром эмиссии 585/16.

Таблица 1. Руководство по выбору флуорофоров для цитометра Attune^® NxT

Точность и чувствительность при любой скорости потока образца

Цитометр Attune^® NxT обеспечивает максимальную чувствительность анализа в самых требовательных экспериментах. Точность выравнивания клеток в потоке поддерживается даже при самых высоких скоростях пропускания образца — до 1000 мкл/мин. Это обеспечивается акустической фокусировкой клеток, которая позволяет получать меньшие значения коэффициента вариации (CV) для успешного отделения слабых сигналов от шума (что повышает воспроизводимость результатов) и разделения сигналов, близких по силе, между собой (Рис. 3).
 

Рис. 3. Измерение чувствительности при разных скоростях потока. Флуоресцентные микросферы (Spherotech Rainbow, 3,2 мкм) анализировали на лидирующем традиционном проточном цитометре (А) и на цитометре с акустической фокусировкой Attune® NxT (B, C), используя лазер 561 нм и фильтры эмиссии 610/20 (A) и 610/15 (B, C). Традиционный цитометр настроили на предельную чувствительность (что соответсвует скорости потока ~12,5 мкл/мин). Цитометр Attune® NxT настроили на 12,5 мкл/мин (как традиционный цитометр, B, и на 500 мкл/мин (40-кратный объем образца, C). Цитометр Attune® NxT показал сравнимые или лучшие результаты даже при самых высоких скоростях пропускания образца.

Минимальная вариабельность данных

Анализ жизненного цикла клеток—лишь один пример эксперимента, в ходе которого крайне важно измерять интенсивность флуоресценции с высочайшей точностью для разделения нескольких популяций клеток. При использовании цитометра Attune^® NxT вариабельность результатов минимальна вне зависимости от скорости пропускания образца. Вам больше не придется жертвовать пропускной способностью в пользу чувствительности анализа.

• Минимальная вариация данных даже при высоких скоростях пропускания образца
• Меньшая вариабельность результатов
• Не нужно жертвовать чувствительностью эксперимента в пользу его скорости

Рис. 9. Минимальная вариация данных при высоких скоростях пропускания образца через цитометр с акустической фокусировкой Attune® NxT. Клетки Jurcat фиксировали и окрашивали припидий иодидом, обрабатывали рибонуклеазой и анализировали при концентрации 106 клеток/мл на цитометре Attune® NxT при разных скоростях пропускания. Левый пик на всех графиках отражает число клеток в фазах G0/G1, правый пик отражает число клеток в фазах G2/M. Вне зависимости от скорости пропускания образца ширина пиков G0/G1 и G2/M и коэффициент вариации (CV%) при использовании цитометра Attune® NxT остается постоянной, даже при самой высокой скорости 1000 мкл/мин.

Быстрое детектирование редких событий

Для детектирования редких популяций клеток с высокой степенью надежности требуется анализ очень большого количества событий, что значительно увеличивает время сбора данных. Скорость анализа на цитометре Attune^® NxT в 10 раз выше, чем на других проточных цитометрах, — до 1000 мкл/мин и до 2 · 10⁷ событий в рамках одного теста. Это обеспечивает высокую скорость детекции редких событий с достаточной точностью без потерь данных.

Рис. 5. Сбор данных с более чем 1 миллиона живых клеток и детекция минорной популяции дендритных клеток (0,2% от общего количества спленоцитов). Плазмоцитоидные дендритные клетки (pDC) — это специфическая популяция клеток, которые вырабатывают большое количество интерферонов I типа в ответ на вирусную. Эти клетки выявляются по иммунофенотипу CD19–/B220high/CD317+. Для четырехцветного окршивания спленоцитов мыши использовались конъюгаты антител CD19-Pacific Blue™, CD317-Alexa Fluor® 488, CD45R/B220-PE и краситель мертвых клеток SYTOX® AADvanced™. Гейтирование по сигналу красителя SYTOX® AADvanced™ выявило живые клетки, среди которых затем были отобраны клетки CD19–. Двухпараметрический анализ клеток CD19– по CD45R/B220 и CD317 был проведен для выявления клеток pDC. Всего было собрано 1,3 млн клеток при скорости потока 500 мкл/мин и концентрации 7,5 · 107 клеток/мл. Плазмацитоидные дендритные клетки были определены как двойные положительные B220+/CD317+ (верхний правый квадрант и составили 0,851% живых клеток CD19–, что соответствует 0,194% всех спленоцитов.

Разбавляйте образцы, чтобы не терять качество данных

Отмывание клеток и лизис эритроцитов могут привести к серьезным повреждениям и потере клеток. Способность цитометра Attune^® NxT феноменально быстро собирать данные с образцов большого объема позволяет исключить шаги отмывания клеток и лизиса эритроцитов, что минимизирует потери клеток и существенно упрощает пробоподготовку. (Рис. 6). Это свойство Attune^® NxT также чрезвычайно полезно при анализе образцов с очень низкой концентрацией. Анализ разбавленных образцов, таких как спинномозговая жидкость (CSF), стволовые клетки и любые другие образцы c низкой концентрацией клеток, требует много времени. Цитометр Attune^® NxT быстро анализирует даже очень разбавленные образцы без потери качества данных. Труднополучаемые образцы, такие как кровь или костный мозг мыши, аспираты тонкоигольной биопсии, а также любые другие образцы c малым количеством клеток, можно окрашивать, а затем разводить без отмывания и лизиса эритроцитов. Высокая скорость сбора данных позволяет анализировать до 4 мл образца всего за 4 минуты. Исключение этапа пробоподготовки дает возможность проводить исчерпывающий анализ без риска потери наиболее ценных образцов.



Рис. 6. Исключение этапа пробоподготовки без снижения качества данных. Цельную кровь (5 мкл) окрашивали антителами, инкубировали и разводили в 4 мл буферного раствора, после чего анализировали на цитометре Attune^® NxT. Излучение с длиной волны 405 нм хорошо поглощается эритроцитами, что позволяет проводить гейтирование по дифференциальному SSC: точечная диаграмма в середине рисунка иллюстрирует отделение лейкоцитов от эритроцитов по SSC излучения 405 и 488 нм. Выбранная популяция лейкоцитов затем анализируется по FSC/SSC для выявления лимфоцитов, моноцитов и гранулоцитов без использования флуоресцентных меток (справа).

Программное обеспечение, соответствующее вашим требованиям

Программное обеспечение Attune^® NxT разработано для интенсивного сбора данных и быстрого анализа результатов с помощью интуитивного интерфейса, в котором легко разберется любой пользователь. Вам не придется просматривать множество окон, все необходимые функции будут под рукой. Параметры экспериментов легко задавать, настраивать и сохранять для будущих исследований. Тесты для автоматического расчета компенсации легко проектируются по встроенному протоколу.

Программа способна визуализировать в реальном времени в виде диаграмм очень большие массивы данных (до 20 млн событий в образце), обновляя изображение на экране без задержек и зависаний при любых изменениях параметров. Дизайн экспериментов и анализ результатов значительно упрощаются с помощью диспетчера конфигурации фильтров эмиссии (filter configuration manager). Этот инструмент позволяет выбрать из выпадающего списка подходящий флуорофор для любого канала флуоресцентной детекции. Списки флуорофоров могут быть дополнены пользователем. При анализе данных название выбранных флуорофоров отображаются в подписи к осям диаграмм.

Рис. 7 и 8. Интерфейс программного обеспечения для Attune^® NxT.